Concentrations urinaires de GHB et de ses nouveaux conjugués d'acides aminés et de carnitine après administration contrôlée de GHB à l'homme

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8983 (2023) Citer cet article

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Le gamma-hydroxybutyrate (GHB) reste un médicament de toxicologie clinique/médico-légale difficile. Son élimination rapide à des niveaux endogènes en est principalement la cause. En particulier dans les agressions sexuelles facilitées par la drogue, le prélèvement d'échantillons a souvent lieu après la fenêtre de détection du GHB. Nous avons cherché à étudier de nouveaux conjugués de GHB avec des acides aminés (AA), des acides gras et ses métabolites d'acides organiques pour leur aptitude en tant que marqueurs d'ingestion/d'application dans l'urine après une administration contrôlée de GHB à l'homme. Nous avons utilisé LC-MS/MS pour la quantification validée d'échantillons d'urine humaine collectés dans le cadre de deux études croisées randomisées, en double aveugle et contrôlées par placebo (GHB 50 mg/kg, 79 participants) à environ 4,5, 8, 11 et 28 h après l'ingestion. Nous avons trouvé des différences significatives (placebo contre GHB) pour tous les analytes sauf deux à 4,5 h. Onze heures après l'administration du GHB, le GHB, les GHB-AA, l'acide 3,4-dihydroxybutyrique et l'acide glycolique présentaient encore des concentrations significativement plus élevées ; à 28 h seulement GHB-glycine. Trois stratégies de discrimination différentes ont été évaluées : (a) concentration seuil de GHB-glycine (1 µg/mL), (b) ratios de métabolites de GHB-glycine/GHB (2,5) et (c) seuil d'élévation entre deux échantillons d'urine (> 5). Les sensibilités étaient respectivement de 0,1, 0,3 ou 0,5. Seul le GHB-glycine a montré une détection prolongée par rapport au GHB, principalement par rapport à un deuxième échantillon d'urine apparié dans le temps et au sujet (stratégie c).

Le gamma-hydroxybutyrate (GHB), un acide gras à chaîne courte, représente un analyte important en toxicologie clinique et médico-légale, non seulement en raison de sa consommation récréative en tant que drogue d'abus (DOA), mais aussi en raison de son utilisation dans les crimes facilités par la drogue ou les agressions sexuelles facilitées par la drogue (DFSA)1,2,3. Les matrices telles que le sang ou l'urine ne permettent que de courtes fenêtres de détection pour le GHB jusqu'à 6 h et 12 h, respectivement4. Pour aggraver les choses, le GHB est également un composé endogène5,6, ce qui rend particulièrement difficile la distinction entre les faibles niveaux de GHB exogène après consommation/administration de GHB et les niveaux endogènes. Des seuils entre 6 et 10 µg/mL sont couramment recommandés dans l'urine pour différencier les niveaux endogènes de GHB et l'apport en GHB1,5,7. Pourtant, des biomarqueurs supplémentaires sont nécessaires pour améliorer la détection et l'interprétation du GHB sur des intervalles plus longs. Le GHB-glucuronide et le GHB-sulfate ont été largement étudiés. Bien que controversées, la plupart des études n'ont trouvé aucun avantage à détecter le GHB-glucuronide8,9,10,11. Plus récemment, les acides organiques formés par la dégradation du GHB ou la bêta-oxydation ont attiré l'attention en tant que biomarqueurs supplémentaires. Les concentrations endogènes d'acide 2,4-dihydroxybutyrique (2,4-DHB), de 3,4-DHB, d'acide glycolique (GA), d'acide succinique (SA) et de succinylcarnitine ont été systématiquement déterminées dans des cohortes plus importantes12,13, et leur utilité générale pour améliorer les fenêtres de détection et l'interprétation du GHB a été démontrée14,15,16. De nouveaux conjugués de GHB (Fig. 1) avec de la carnitine, des acides aminés (glycine, glutamate, taurine, phénylalanine), du pentose, des acides gras, des phospholipides et certaines caractéristiques encore inconnues (U3, U4, U16) ont également pointé vers des marqueurs GHB supplémentaires prometteurs. Ils ont été découverts soit par un profilage métabolique non ciblé17,18, soit par des approches fondées sur des hypothèses19,20,21. Cependant, des études systématiques sur leurs concentrations urinaires sont toujours en cours. Par conséquent, nous avons cherché à caractériser quantitativement l'excrétion urinaire du GHB, du GHB-carnitine, du GHB-glycine, du GHB-glutamate, du GHB-taurine, du GHB-phénylalanine, des esters d'acides gras du GHB (C8-C18, C18:1) et des acides organiques 2,4-DHB, 3,4-DHB, GA, SA, succinylcarnitine après administration contrôlée de GHB chez l'homme et d'évaluer leur utilité pour détection de l'apport/de l'application de GHB en appliquant trois stratégies de discrimination différentes.

Structures chimiques des conjugués de GHB nouvellement identifiés avec les acides aminés glycine, glutamate et taurine (à gauche), carnitine, acides gras ou pentose (à droite).

Les concentrations de chaque participant déterminées à l'aide d'une méthode validée de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS)21 et de créatinine urinaire sont fournies dans le tableau S1. La comparaison des concentrations calculées entre les isotopes 12C et 13C a indiqué un bon accord dans la plage d'étalonnage, mais un accord plus faible pour le 12C à des concentrations plus élevées (Fig. S1 supplémentaire). Par conséquent, les résultats de 13C ont été utilisés comme valeurs approximatives pour les concentrations de GHB dans les échantillons dépassant l'étalonnage. Le tableau 1 fournit un résumé (moyenne, médiane, plage) des concentrations déterminées pour chaque condition non/ajustée à la créatinine, respectivement. Les concentrations de créatinine se sont révélées indépendantes du traitement, du sexe ou de la maladie, mais ont montré une variation intrajournalière attendue (étude II, 11 h, Fig. S2 supplémentaire). Des conjugués GHB-carnitine et GHB-acides aminés ont été détectés dans les sessions placebo et GHB. Seules les concentrations de GHB-taurine étaient inférieures à la limite de quantification (LOQ) de 0,05 µg/mL dans tous les échantillons de placebo. Les conjugués d'acides gras GHB n'ont pu être détectés dans aucune des conditions de traitement. Comme prévu, les concentrations les plus élevées de tous les composés mesurés ont été observées dans le premier échantillon d'urine recueilli lors de la session GHB. Par rapport à un nombre limité de cas authentiques publiés dans des études antérieures (ForTox pos 121, ForTox pos 215, n = 7 chacun, Tableau 1), les concentrations déterminées après des administrations contrôlées (4,5 h) étaient plus faibles pour tous les composés à l'exception du GHB-carnitine. La corrélation de Spearman entre les concentrations non ajustées et ajustées à la créatinine était élevée (r > 0,8). Seuls les isomères du DHB et le GHB-glucuronide (r 0,4–0,6), le SA et la succinylcarnitine (r 0,6–0,7) ont montré une faible (plus) corrélation (Fig. S3 supplémentaire). La comparaison entre les échantillons de 4,5 h des cohortes I et II n'a révélé aucune différence pertinente, sauf pour le GHB-carnitine, où des concentrations significativement plus élevées ont été mesurées dans la cohorte d'étude I. Les concentrations de conjugués d'acides aminés étaient légèrement plus élevées dans la cohorte II. Les concentrations étaient indépendantes de l'âge, du sexe et du trouble dépressif sous-jacent. Seules les concentrations de SA étaient significativement plus élevées chez les femmes à tout moment et 2,4-DHB chez les patients dépressifs à 4,5 h (Fig. S4 supplémentaire). Nous avons constaté que les concentrations endogènes de GHB et de métabolites du GHB (placebo) étaient indépendantes de la journée, à l'exception du GHB-glucuronide et de la succinylcarnitine, qui présentaient des concentrations significativement plus faibles l'après-midi (Fig. 3, Fig. S5 supplémentaire). La corrélation de Spearman entre les concentrations de métabolites et celles de GHB dans la cohorte d'étude II était élevée à 4,5 h et 11 h et modérée à 28 h, comme le montrent les exemples représentatifs de la figure 2A. En revanche, la concentration initiale n'a pas influencé les concentrations à des moments ultérieurs, comme l'indique l'absence de corrélation entre les concentrations urinaires précoces (4, 5 h) et celles à 11 h ou 28 h, respectivement (Fig. 2B).

Analyse de corrélation (spearman, r) entre (A) la concentration urinaire de GHB (axe des x) et les concentrations de GHB-glycine ou de 3,4-DHB à 4,5 h (gris clair), 11 h (gris foncé) et 28 h (noir) après l'apport de GHB et (B) corrélation entre les concentrations à 4,5 h par rapport à celles à 11 h (gris foncé) et 28 h (noir). Les lignes pleines représentent les résultats de la corrélation linéaire.

Les concentrations dérivées des séances de placebo et de GHB de la cohorte d'étude II à 4,5, 11 et 28 h après l'ingestion sont représentées sous forme de boîtes à moustaches sur la Fig. 3 et la Fig. S5 supplémentaire. Les concentrations de chaque participant sont présentées à titre d'exemples représentatifs pour le GHB, le GHB-glycine et le GHB-carnitine, le 3,4-DHB et le GA (Fig. S6 supplémentaire). Des différences significatives entre le placebo et le traitement au GHB ont été observées pour tous les analytes à l'exception du SA et de la succinylcarnitine au moment du prélèvement le plus précoce. Onze heures après l'administration du GHB, le GHB, les acides aminés GHB, le 3,4-DHB et l'AG avaient encore des concentrations significativement plus élevées que le placebo. 28 h après la prise, seul le GHB-glycine permettait une discrimination statistique. Le GHB-pentose et la caractéristique U4 ont montré un certain potentiel pour distinguer le GHB exogène du GHB endogène.

Boîtes à moustaches des concentrations d'urine pour le placebo (gris clair) et le traitement au GHB (gris foncé) recueillies dans l'étude II à 4,5, 11 et 28 h après l'ingestion. La comparaison statistique a été effectuée à l'aide d'un test unilatéral non paramétrique de Mann–Whitney (p < 0,05) : *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001.

Sur la base des concentrations de placebo, des valeurs seuils ont été sélectionnées et testées pour leur sensibilité à détecter l'apport de GHB à différents moments après l'administration. Les résultats pour la spécificité, la sensibilité et la VPP sont résumés dans le tableau 2. En utilisant les seuils sélectionnés, la GHB-glycine a obtenu de meilleurs résultats que le GHB (sensibilité 0, 4 contre 0, 1) ou d'autres biomarqueurs (par exemple, sensibilité 3, 4-DHB 0, 1) jusqu'à au moins 11 h. Après 28 h, même la GHB-glycine a cependant permis la détection/discrimination du GHB à partir des niveaux endogènes dans seulement 9 % des cas.

Les ratios de métabolites (métabolite/GHB, MR) ont augmenté de 4,5 à 28 h après le GHB, mais pas le traitement par placebo, comme indiqué de manière représentative pour le GHB-glycine, le GHB-carnitine, le 3,4-DHB et le GA dans la Fig. 4. Les concentrations de GHB les plus élevées ont été observées 4,5 h après l'administration de GHB et ont entraîné une diminution significative des MR par rapport au placebo. Seuls les écarts interquartiles (IQR) GHB-glycine dépassaient ceux observés dans des conditions placebo. Le fait de prendre l'IQR MR le plus élevé du traitement placebo (2,5) comme seuil provisoire a entraîné une sensibilité (0,3) et une spécificité (0,9) inférieures par rapport à la stratégie a) à 11 h. La sensibilité (0,3) avec une spécificité similaire a été améliorée après 28 h.

Rapports de métabolites (concentration d'analyte/GHB) pour le placebo (gris clair) et le traitement au GHB (gris foncé) calculés à partir d'échantillons d'urine dans l'étude II à 4,5, 11 et 28 h après l'ingestion. Les lignes pointillées représentent la plage interquartile la plus élevée et la plus basse du traitement par placebo sur tous les points de collecte.

De plus, nous avons évalué l'utilité de niveaux élevés d'analyte (> 5) entre deux échantillons d'urine (sujet et appariés dans le temps). Dans l'ensemble, de meilleures sensibilités ont été observées par rapport à une application de coupure générale (stratégie a ; tableau 2). Après 28h, environ 50% voire 90% des cas GHB-positifs seraient classés correctement par GHB-glycine ou GHB-pentose, respectivement. Cependant, une spécificité légèrement inférieure a été détectée pour le GHB-glycine car, dans certaines paires d'urine, un échantillon était négatif pour le biomarqueur correspondant.

L'interprétation actuelle des concentrations urinaires de GHB doit encore être améliorée et plusieurs études ont été réalisées pour trouver de nouveaux biomarqueurs8,9,10,11,12,15,16,17,18,19,22,23. Nous avons récemment proposé de nouveaux conjugués urinaires de GHB avec différents acides aminés ou de la carnitine (Fig. 1)17,18, mais les données quantitatives sur des intervalles de temps plus longs après la prise de GHB sont manquantes. L'étude actuelle est la première à fournir des valeurs quantitatives pour le GHB, ses conjugués et les acides organiques après administration contrôlée de GHB à l'homme.

Des échantillons d'urine de deux cohortes d'étude (79 participants) ont été (ré)analysés. Alors que la cohorte d'étude II consistait en un essai clinique récent (environ 6 mois de stockage à - 80 ° C), la cohorte d'étude I a été stockée pendant env. 8 ans (− 80 °C) avant quantification dans l'étude actuelle. La stabilité à long terme pendant la validation de la méthode a été testée jusqu'à trois mois à − 20 °C. Une tendance à la baisse des concentrations de conjugués d'acides aminés a été observée, mais seule la GHB-carnitine a diminué de manière significative21. En conséquence, la moyenne et la plage des conjugués d'acides aminés du GHB dans les échantillons d'urine prélevés 4,5 h après l'apport de GHB dans la cohorte I de l'étude étaient légèrement inférieures à celles de la cohorte II. Dans l'ensemble, ces résultats prouvent une stabilité suffisante des conjugués d'acides aminés GHB, du moins lorsqu'ils sont stockés à - 80 ° C. Étonnamment, nous avons trouvé des concentrations significativement plus élevées de GHB-carnitine dans la cohorte I par rapport à II (tableau 1). Cependant, la GHB-carnitine s'est avérée instable également dans les échantillons extraits. La substance est hautement hygroscopique et difficile à manipuler dans des conditions de laboratoire standard. Pour éviter les problèmes d'interprétation dus au stockage des échantillons, nous avons concentré l'évaluation des données primaires sur la cohorte d'étude II, compte tenu de la longue collection d'échantillons appariés.

L'isotope 13C d'origine naturelle représente généralement environ 1,1 % de tous les atomes de carbone, produisant un signal MS beaucoup plus faible que le 12C, dont il a été démontré qu'il augmente la plage dynamique24,25. Nous avons pu montrer lors de la validation de la méthode que les concentrations de GHB calculées via l'isotope 13C correspondaient bien aux résultats d'une méthode précédente de GHB21. La présente étude s'est principalement concentrée sur les nouveaux métabolites du GHB, en particulier sur la différenciation entre les niveaux endogènes et l'apport exogène en GHB. Nous avons donc considéré les résultats de 13C comme des valeurs approximatives pour les concentrations de GHB dans les échantillons dépassant la plage d'étalonnage comme suffisantes et avons omis d'autres étapes de dilution.

La question de savoir si les concentrations urinaires quantitatives doivent être ajustées aux taux de créatinine fait l'objet de discussions critiques26. Dans les échantillons ponctuels d'urine, l'ajustement de la créatinine est souvent recommandé pour tenir compte de l'état de dilution individuel27. En toxicologie clinique et médico-légale, la créatinine urinaire est généralement déterminée comme un paramètre de validité28,29, mais l'interprétation des concentrations urinaires de médicament ne tient généralement pas compte des taux de créatinine. Nous avons observé une forte corrélation entre les concentrations ajustées à la créatinine et non ajustées, à l'exception des isomères du DHB. En conséquence, nous nous sommes concentrés sur les résultats et la discussion sur les concentrations non ajustées.

Nous avons détecté des conjugués de GHB dans toutes les conditions et à tous les moments de collecte, mais pas dans tous les échantillons d'urine individuels (tableau 1). L'âge, le sexe ou le trouble dépressif n'ont pas influencé les concentrations. Seuls les esters d'acides gras sont restés indétectables dans tous les échantillons d'urine, probablement en raison de leur haute lipophilie et de la faible excrétion rénale qui en résulte.

Pour différencier les niveaux endogènes des résidus d'application exogène, il est nécessaire de connaître les niveaux endogènes et leurs possibles fluctuations intra-/inter-journalières. Nous avons trouvé des fluctuations significatives uniquement pour la succinylcarnitine, tandis que les isomères du DHB et la glycine du GHB ont montré une légère tendance non significative pour des niveaux plus élevés tôt le matin. Dans l'ensemble, les concentrations d'acides organiques de GHB dans les échantillons de placebo se situaient dans des plages similaires à celles publiées précédemment par Kim et al.13 et généralement légèrement inférieures à celles de Jarsiah et al.12 Pour les nouveaux conjugués de GHB, nous fournissons les premières données. Pourtant, davantage d'échantillons sans l'application de GHB doivent être analysés pour déterminer de manière fiable les niveaux endogènes. Des études futures pourraient également viser des LOQ encore plus faibles pour le GHB-phénylalanine et le GHB-taurine.

Suite au traitement au GHB, nous avons trouvé les concentrations les plus élevées au moment de l'échantillonnage le plus précoce. Pour les acides organiques, nos résultats de cette cohorte plus large s'alignent sur les découvertes précédentes de Kueting et al. suite à la prise de GHB chez cinq patients narcoleptiques (22–34 mg/kg de poids corporel)16. Cependant, par rapport à un nombre limité de cas authentiques (Tableau 1, ForTox pos 121), les concentrations déterminées après des administrations contrôlées (4,5 h) étaient plus faibles pour tous les composés à l'exception du GHB-carnitine. Jarsiah et al. ont déterminé des concentrations similaires pour les isomères du DHB et le GA dans les cas médico-légaux de GHB (tableau 1, ForTox pos 215). Les explications possibles incluent une collecte d'urine plus précoce ou des doses plus élevées de GHB consommées/administrées. Le temps d'échantillonnage par rapport à la prise de médicaments et aux doses ingérées est le plus souvent inconnu dans les affaires médico-légales. Le stockage des échantillons et la stabilité des analytes peuvent également être critiques. Des expériences récentes de stabilité à long terme sur trois mois ont indiqué des augmentations significatives des niveaux de 2,4- et 3,4-DHB chez les cas GHB-positifs, mais pas chez les cas GHB-négatifs. Cependant, cet effet n'a pas été démontré pour les conjugués GA ou GHB21.

Les concentrations de métabolites du GHB, à l'exception du GHB-carnitine, du SA et de la succinylcarnitine, ont montré une forte corrélation avec celles du GHB, en particulier aux concentrations les plus élevées obtenues par application exogène. Nous avons observé une corrélation plus faible à des moments ultérieurs (28 h), où les concentrations ont une forte probabilité d'être d'origine endogène, en particulier pour les acides organiques (Fig. 2). Pour le 3,4-DHB, les pentes entre les corrélations d'origine exogène et endogène semblent différer. Les concentrations de conjugué ou d'acide organique plusieurs heures après l'ingestion de GHB ne dépendaient pas de la concentration initiale de GHB. Cependant, malheureusement, seuls trois points temporels étaient disponibles, ce qui n'a pas permis de calculer les taux d'élimination et la cinétique sous-jacente. Deuxièmement, le premier échantillon d'urine a été prélevé à 4,5 h, ce qui ne reflète pas nécessairement la concentration maximale atteinte dans les urines.

Par conséquent, sur la base des données contrôlées disponibles, il ne peut être totalement exclu que des doses plus élevées de GHB n'entraînent (pas) des concentrations plus élevées de conjugués de GHB, qui peuvent également être associées à une détectabilité plus longue.

Les concentrations moyennes de GHB étaient inférieures aux seuils de GHB recommandés de 10 ou 6 µg/mL déjà 11 h après l'ingestion, ce qui est conforme aux fenêtres de détection connues du GHB4. Néanmoins, les concentrations étaient encore statistiquement significativement plus élevées qu'après le placebo. La recherche exploratoire initiale de biomarqueurs17,18 a suscité l'espoir que les conjugués d'acides aminés du GHB ne se produisent pas de manière endogène, ce qui en fait des candidats idéaux comme marqueurs exogènes du GHB. Cependant, les méthodes de détection analytique plus sensibles de la présente étude ont également révélé de faibles niveaux endogènes de ces conjugués. Le GHB-pentose était le seul analyte à peine présent dans les échantillons d'urine placebo (< 10 %) mais toujours détectable après 28 h (Fig. S6 supplémentaire). Malheureusement, aucun matériau de référence n'est disponible et sans validation et quantification de la méthode pour ce paramètre, les conclusions restent limitées. Il en va de même pour le composé encore inconnu U4. Étant clairement liée à l'administration du GHB, l'élucidation de la structure est essentielle pour des études ultérieures17.

Sur la base de la concentration endogène la plus élevée par analyte détectée dans les échantillons d'urine du traitement placebo (égale à 100 % de spécificité), nous avons choisi des valeurs seuils pour les métabolites du GHB et les avons testés pour leur sensibilité à détecter l'apport de GHB à différents moments. De plus, si les concentrations dans les échantillons authentiques (tableau 1) dépassaient celles des cohortes d'études contrôlées, un deuxième seuil plus élevé, égal ou très similaire à une publication précédente, était évalué15. La GHB-glycine (seuil provisoire de 1 µg/mL) se distingue comme le biomarqueur le plus prometteur qui peut prolonger la fenêtre de détection du GHB à environ 28 h, mais toujours pas avec la sensibilité souhaitée, idéalement proche de un. Kueting et al. ont décrit des concentrations urinaires élevées ajustées en fonction de la créatinine de 2,4-DHB, 3,4-DHB et GA après l'apport de GHB pendant jusqu'à 22 h par rapport à une concentration endogène initiale adaptée au patient avant l'apport de GHB16. Ces résultats n'ont pas pu être confirmés dans notre ensemble de données. Seul le 3,4-DHB a permis une identification correcte de l'apport de GHB pendant environ 11 h, mais toujours avec une faible sensibilité (14 %). Fait intéressant, les mêmes échantillons d'urine (H19, H20, H21, P21 et P25) avaient des concentrations plus élevées de GHB, GHB-glycine, GHB-pentose et 3,4-DHB par rapport aux autres participants, en particulier à 11 h et parfois après 28 h (Fig. S6 supplémentaire). Jusqu'à présent, cette découverte n'a pas pu être expliquée, mais s'est avérée indépendante de l'âge, du sexe, de la co-médication ou de la créatinine urinaire.

L'administration de GHB entraîne des concentrations urinaires de GHB plusieurs fois plus élevées par rapport aux niveaux endogènes. Par conséquent, le calcul des MR des métabolites du GHB sur les concentrations de GHB produira initialement des MR extrêmement faibles par rapport au placebo, augmentant ou dépassant les ratios endogènes au fil du temps (Fig. 4). Si les métabolites du GHB sont éliminés plus lentement que le GHB, les MR correspondants à des moments ultérieurs devraient dépasser ceux des cas sans apport de GHB. De tous les MR évalués, seul le GHB-glycine a suivi cette tendance attendue, tandis que les valeurs médianes se situaient toujours dans les limites du placebo. La sélection de l'IQR MR le plus élevé du traitement placebo comme limite provisoire a entraîné une sensibilité légèrement supérieure, mais toujours trop faible, pour une détection correcte de l'apport de GHB dans des échantillons d'urine de 28 h par rapport au seuil de concentration unique.

Comme troisième approche de discrimination, nous avons testé une détermination de ratio entre deux échantillons d'urine d'un même individu, tenant compte du niveau endogène d'un individu. Nous avons utilisé des échantillons de placebo appariés dans le temps pour une évaluation préliminaire afin d'éviter la variation intra-journalière de l'analyte. La méthode analytique n'était pas suffisamment sensible pour obtenir des valeurs quantitatives dans tous les échantillons de placebo pour les conjugués de GHB. La formation du rapport sur la base des concentrations calculées n'a donc pas été possible dans suffisamment de cas. Au lieu de cela, nous avons utilisé des rapports de surface de pic (analyte/étalon interne (IS)), avec l'avantage supplémentaire qu'aucun matériau de référence n'est nécessaire. Ces normes ont été en partie synthétisées en interne et ne sont pas encore disponibles dans le commerce30. Les différences d'abondance dans les échantillons d'urine placebo (4,5 h contre 28 h) ont été utilisées comme une cohorte sans GHB exogène et ont montré des élévations maximales de 5 (exception GHB, GHB-glutamate, GHB-phénylalanine, SA). Cinq a donc été retenu comme seuil d'élévation potentiel. Les composés non détectables dans les échantillons individuels ont reçu un rapport surface de pic fictif/IS de 0,00001 (facteur minimum 100 inférieur aux valeurs d'échantillon authentiques les plus basses) pour contourner la division par zéro erreur. Cette approche a donné une sensibilité beaucoup plus élevée, également 28 h après la prise de GHB. Des valeurs de spécificité plus faibles ont été observées en raison de paires d'urine (placebo) où les analytes étaient indétectables dans l'un des échantillons. Dans ces circonstances, des taux déjà très bas dans les premiers prélèvements d'urine conduiraient à une élévation théoriquement infinie. En prenant le GHB-glycine comme exemple, la suppression des six paires avec du GHB-glycine indétectable dans l'un des échantillons a de nouveau augmenté la spécificité de 0,85 à 1. Nos données préliminaires suggèrent que la comparaison avec un deuxième échantillon d'urine pourrait être la meilleure stratégie pour améliorer la détection du GHB. Pourtant, davantage de données, confirmant les seuils d'élévation proposés et évaluant les résultats d'échantillons de cas de routine en double sont nécessaires. Par conséquent, nous vous recommandons de prélever des échantillons d'urine 24 h (synchronisés) après l'échantillon initial.

Notre étude présentait certaines limites car les échantillons réanalysés provenaient d'études qui n'avaient pas été initialement conçues pour notre question de recherche. De plus, une dose thérapeutique de GHB (narcolepsie) a été administrée, alors que des doses plus élevées sont couramment utilisées dans les cas de DFSA. Seuls trois points de temps de collecte jusqu'à 28 h étaient disponibles, ne permettant pas une analyse pharmacocinétique appropriée (par exemple, le taux d'élimination).

Nous fournissons les premières données complètes sur divers biomarqueurs du GHB après administration contrôlée de GHB. Les conjugués GHB-AA et l'acide 3,4-dihydroxybutyrique se sont révélés appropriés comme marqueurs de détection supplémentaires du GHB. Par conséquent, l'analyse actuelle du GHB devrait être étendue du GHB uniquement à plusieurs autres biomarqueurs. Cependant, seule la GHB-glycine a montré une détection prolongée par rapport au GHB. Les meilleures sensibilités ont été obtenues lorsqu'un échantillon d'urine a été comparé à un deuxième échantillon d'urine apparié selon le temps et le sujet (stratégie c). Pourtant, la collecte d'un deuxième échantillon d'urine de victimes de DFSA pourrait être critique, et (plus) d'échantillons de routine doivent être analysés avec cette approche avant l'évaluation finale.

Nous avons utilisé des échantillons d'urine provenant de deux études croisées randomisées, équilibrées, en double aveugle et contrôlées par placebo réalisées à Zurich, en Suisse. Ils ont été initialement conçus pour caractériser les effets favorisant le sommeil du GHB chez les participants en bonne santé (étude I) et les effets d'amélioration de la mémoire chez les participants en bonne santé et les patients souffrant de troubles dépressifs majeurs (étude II). L'approbation a été accordée par la Commission cantonale d'éthique de Zurich et Swissmedic. Les études ont été enregistrées sur ClinicalTrials.gov (NCT02342366 et NCT04082806, respectivement) et tous les protocoles et méthodes d'étude étaient conformes aux directives pertinentes et à la déclaration d'Helsinki. Du GHB (50 mg/kg de poids corporel Xyrem®) ou un placebo ont été administrés dissous dans 2 dL de jus d'orange. Entre les séances (placebo et GHB), une phase de sevrage de sept jours a été maintenue. Tous les participants ont été informés des risques potentiels et ont fourni un consentement éclairé écrit, conformément à la déclaration d'Helsinki.

La conception de l'étude est décrite en détail ailleurs31. En bref, dans l'étude principale (n = 20 hommes en bonne santé, âge moyen 25,8 ± 2,5, S01–S20), des échantillons d'urine du matin ont été prélevés à 7h00 (4,5 h) après l'administration de GHB/placebo à 2h30 du matin de la nuit expérimentale. Dans une première étude pilote, GHB/placebo ont été administrés de la même manière, mais à 23h le soir de l'expérimentation. L'urine du matin (n = 20, SP01–SP20) a été recueillie à 7 h 00 (8 h). Tous les échantillons ont été stockés à - 80 ° C pendant environ huit ans et ont subi un maximum de deux cycles de congélation-décongélation. Ces échantillons d'urine étaient déjà utilisés pour d'anciennes enquêtes sur le métabolome non ciblé17,18.

La cohorte d'étude II a été obtenue à partir d'une étude clinique récente sur l'administration de médicaments chez des volontaires sains (H, n = 21, 6 hommes, 15 femmes, âge moyen 27 ± 6,6) et des patients atteints de trouble dépressif majeur (P, n = 19, 6 hommes, 13 femmes, âge moyen 27 ± 6,9). Des échantillons d'urine prélevés la nuit expérimentale tôt le matin (4,5 h ± 1 h), l'après-midi (11 h ± 1 h) et le lendemain matin (28 h ± 1 h) ont été inclus dans les expériences actuelles de quantification du GHB. Les échantillons ont été stockés à - 80 ° C pendant environ 6 mois jusqu'à l'analyse et ont subi un maximum de deux cycles de congélation-décongélation. D'autres détails de l'étude portant sur les objectifs de l'étude originale seront publiés ailleurs.

Les produits chimiques et les solvants utilisés et une description détaillée de la méthode LC-MS/MS validée sont fournis en référence21. Des échantillons d'urine authentiques (100 µL) ont été dopés avec 10 µL de solution IS (GHB-d6 5 µg/mL ; butyrylcarnitine-d3 5 µg/mL). Tous les échantillons ont été dilués avec 500 µL d'acétonitrile, centrifugés (14 000 tr/min, 15 min) et le surnageant transféré dans des flacons d'échantillonneur automatique. L'analyse a été effectuée sur un système LC Shimadzu LC-40Dx3 (Shimadzu, Duisburg/Allemagne) couplé à un MS quadripolaire à piège à ions linéaire Sciex 5500 QTtrap (Sciex, Darmstadt/Allemagne) contrôlé par le logiciel Analyst (version 1.7.2). En bref, la séparation chromatographique a été effectuée sur une colonne SeQuant ZIC-HILIC (Merck, Darmstadt/Allemagne) après élution en gradient. Le débit était de 0,35 mL/min. Le MS a fonctionné en mode avancé de surveillance de réactions multiples planifiées en utilisant une à trois transitions par analyte, y compris les isotopes 13C pour le GHB et la GHB-carnitine. Les calibrateurs ont été préparés dans de l'urine synthétique.

La créatinine a été déterminée par la réaction de Jaffe sur un appareil Indiko Plus (Thermo Scientific, Braunschweig/Allemagne).

Le logiciel MultiQuant (3.0.3, Sciex) a été utilisé pour l'intégration et la quantification des pics. L'analyse statistique a été effectuée dans GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, San Diego/CA/USA). Des comparaisons de groupe (placebo contre GHB ; différents moments après l'ingestion) ont été effectuées dans les cohortes d'étude I et II par le test unilatéral de Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis suivi du test de corrections multiples de Dunn (p < 0,05). L'influence du sexe et de la maladie a été évaluée à l'aide d'une ANOVA à deux voies avec le test de comparaison multiple de Sidak. Nous avons testé la corrélation incluant l'âge avec l'analyse de corrélation de Spearman.

Différentes stratégies ont été évaluées pour leur capacité à discriminer entre le traitement au GHB et les niveaux endogènes dans la cohorte II de l'étude : (a) les concentrations seuils des nouveaux métabolites du GHB, (b) les rapports métaboliques (MR, concentration de métabolite/concentration de GHB), et (c) des rapports de surface de pic élevés (analyte/IS) entre deux échantillons d'urine. Des échantillons d'urine après le traitement au GHB ont été prélevés comme urine 1 et des échantillons placebo appariés dans le temps comme urine 2. Un ensemble de données sans GHB exogène a été formé à partir des meilleurs échantillons placebo appariés dans le temps à 4,5 h (urine 1) ou 28 h (urine 2). Pour évaluer la qualité des stratégies, le nombre de vrais positifs (TP), de faux positifs (FP), de vrais négatifs (TN), de faux négatifs (FN), la sensibilité résultante (TP/(TP + FN), la spécificité (TN/TN + FP) et la valeur prédictive positive (PPV = TP/(TP + FP)) ont été calculés.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs tiennent à remercier leur collègue Maja Keller pour son soutien et sa discussion et expriment leur gratitude à Emma Louise Kessler, MD, pour son généreux héritage qu'elle a fait don à l'Institut de médecine légale de l'Université de Zurich, en Suisse, à des fins de recherche. L'étude II a été soutenue financièrement par une subvention de projet du Fonds national suisse (SNF Nr. 175780) accordée à ES.

Département de pharmacologie médico-légale et de toxicologie, Institut de médecine légale de Zurich, Université de Zurich, Winterthurerstrasse 190/52, 8057, Zurich, Suisse

Andrea E. Steuer, Dario A. Dornbierer et Thomas Kraemer

Département de psychiatrie, psychothérapie et psychosomatique, Hôpital psychiatrique universitaire de Zurich, Université de Zurich, 8032, Zurich, Suisse

Francesco Bavato, Laura K Schnider, Dario A Dornbierer, Oliver G Bosch, Boris B Quednow et Erich Seifritz

Neuroscience Center Zurich, Université de Zurich et Ecole polytechnique fédérale de Zurich, 8057, Zurich, Suisse

Boris B. Quednow et Erich Seifritz

Institut des sciences pharmaceutiques, Ecole polytechnique fédérale de Zurich, 8093, Zurich, Suisse

Christian Steuer

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FB, LKS, DAD, OGB, BBQ et ES ont conceptualisé l'étude clinique et la collecte d'échantillons ; AES et TK ont conçu le montage analytique et l'évaluation ; AES a effectué l'analyse et l'évaluation des données ; AES a rédigé le manuscrit; TK, FB et BBQ ont révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit et approuvé la version finale.

Correspondance à Andrea E. Steuer.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Steuer, AE, Bavato, F., Schnider, LK et al. Concentrations urinaires de GHB et de ses nouveaux conjugués d'acides aminés et de carnitine après administration contrôlée de GHB à l'homme. Sci Rep 13, 8983 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36213-1

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Reçu : 17 janvier 2023

Accepté : 31 mai 2023

Publié: 02 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36213-1

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